Referência de laboratório principal: Faixas de ajuste permitidas para HPLC e GC em ChP, USP, Ph.Eur.

As farmacopeias nacionais fornecem métodos de teste padronizados para o trabalho laboratorial de rotina. Embora pareçam conter disposições restritivas rígidas, certos ajustes são permitidos. Este artigo discute as faixas de ajuste permitidas para testes cromatográficos especificadas em diversas farmacopeias de referência comum.

Farmacopeia Chinesa
Fase estacionária: As propriedades físico-químicas do material de enchimento não devem ser modificadas, incluindo o material do substrato, a modificação da superfície e a fase ligada. A transição de partículas totalmente porosas para partículas superficialmente porosas é permitida quando as condições acima forem atendidas.
Tamanho da partícula (dp) e comprimento da coluna (L): Após a alteração do tamanho da partícula ou do comprimento da coluna, o valor de L/dp (ou valor de iV) deve estar entre -25% e +50% do valor original.
Vazão: Se o diâmetro interno da coluna ou o tamanho das partículas do enchimento forem alterados, calcule a vazão usando a fórmula correspondente.
[Fórmula omitida]
Ajustes adicionais podem ser feitos de acordo com a pressão real do sistema e o tempo de retenção. Em eluição isocrática, a vazão pode ser ajustada em até ±50%. Em eluição em gradiente, os ajustes devem seguir apenas a fórmula; não é permitida uma faixa de ajuste estendida.
Volume de injeção: Ajuste para atender aos requisitos de adequação do sistema. Se as dimensões da coluna forem modificadas, calcule o volume de injeção usando a fórmula correspondente e faça o ajuste fino com base nos requisitos de sensibilidade.
[Fórmula omitida]
Programa de Eluição em Gradiente: Mantenha múltiplos de volume de eluição idênticos para colunas de diferentes especificações, a fim de garantir perfis de gradiente consistentes. Leve em consideração as diferenças no volume de repouso do sistema entre os instrumentos.
[Fórmula omitida]
Proporção da fase móvel:
Eluição isocrática: O componente minoritário da fase móvel pode ser ajustado por um valor relativo de ±30% ou um valor absoluto de ±2%, prevalecendo o que resultar na maior magnitude. A proporção desse componente minoritário deve ser inferior a (100/n)%, onde n = número de componentes da fase móvel.
Eluição em gradiente: As proporções dos componentes da fase móvel podem ser ajustadas moderadamente para atender aos critérios de adequação do sistema. A força de eluição da composição final da fase móvel não deve ser menor que a do gradiente original.
Concentração de sal do tampão da fase móvel: ajustável com uma precisão de ±10%.
Temperatura da coluna: Salvo indicação em contrário, ±10 °C para eluição isocrática; ±5 °C para eluição em gradiente.
Valor de pH: Salvo indicação em contrário, o pH da fase móvel aquosa pode ser ajustado dentro de ±0,2 unidades de pH.
Comprimento de onda de detecção: Nenhuma modificação permitida.
Notas:
F1 = vazão especificada na monografia; F2 = vazão ajustada
dc1 = diâmetro interno original da coluna; dc2 = diâmetro interno ajustado da coluna
dp1 = tamanho original das partículas de empacotamento; dp2 = tamanho ajustado das partículas de empacotamento
L1 = comprimento original da coluna; L2 = comprimento ajustado da coluna
Vinj1 = volume de injeção original; Vinj2 = volume de injeção ajustado
tG1 = tempo de gradiente original; tG2 = tempo de gradiente ajustado
Farmacopeia dos Estados Unidos
pH do tampão da fase móvel (HPLC): Ajustar dentro de ±0,2 unidades de pH ou dentro da faixa especificada; aplica-se tanto à eluição isocrática quanto à eluição em gradiente.
Concentração de sal do tampão da fase móvel (HPLC): ±10% (desde que o pH permaneça aceitável); aplica-se tanto à eluição isocrática quanto à eluição em gradiente.
Proporção dos componentes da fase móvel (HPLC): Para componentes que representam ≤50% do volume da fase móvel, é permitido um ajuste relativo de ±30%. No entanto, o ajuste absoluto de qualquer componente individual não deve exceder ±10% da composição total da fase móvel. Para fases móveis ternárias, ajuste cada componente individualmente; para fases móveis binárias, os ajustes se aplicam ao componente minoritário. Exemplos para sistemas binários e ternários são mostrados abaixo:
Exemplo binário 1: Proporção da fase móvel 50:50. Uma variação relativa de 30% para o componente de 50% equivale a 15%, o que excede o limite de composição absoluta de ±10%. Portanto, o ajuste é restrito a ±10% absoluto; intervalo permitido: 40:60 ~ 60:40.
Exemplo binário 2: Proporção da fase móvel 2:98. Uma variação relativa de 30% para o componente minoritário de 2% equivale a 0,6%, o que está em conformidade com o limite de composição absoluta de ±10%. Intervalo permitido: 1,4:98,6 ~ 2,6:97,4.
Exemplo ternário: Proporção da fase móvel 60:35:5. Uma alteração relativa de 30% para o componente de 35% resulta em 10,5%, excedendo o limite de composição absoluta de ±10%, portanto, o ajuste para este componente é limitado a ±10% absoluto. Uma alteração relativa de 30% para o componente minoritário de 5% resulta em 1,5%. Faixas de ajuste aceitáveis: 50:45:5 ~ 70:25:5 ou 58,5:35:6,5 ~ 61,5:35:3,5.
Comprimento de onda de detecção UV (HPLC): O comprimento de onda indicado na monografia não pode ser alterado. Com base nas especificações do fabricante do detector ou em dados de validação separados, o erro de medição do comprimento de onda não deve exceder ±3 nm.
Fase estacionária:
Comprimento da coluna (GC): Ajustável dentro de ±70%.
Comprimento da coluna (HPLC): Consulte a seção de tamanho de partícula.
Diâmetro interno da coluna (HPLC): Permitido se a velocidade linear for mantida; consulte a seção de vazão de HPLC.
Diâmetro interno da coluna (GC): Ajuste máximo de ±50%.
Espessura do filme (colunas capilares de GC): Ajustável de −50% a +100%.
Tamanho de partícula (HPLC): Tanto o tamanho da partícula quanto o comprimento da coluna podem ser modificados. A relação L/dp deve permanecer constante ou estar dentro de −25% a +50% em relação ao valor de referência. Para partículas superficialmente porosas, combinações alternativas de comprimento da coluna (L) e tamanho da partícula (dp) são aceitáveis, desde que o número de pratos teóricos (N) esteja dentro de −25% a +50% em comparação com a coluna de referência.
Note que números de pratos teóricos mais altos produzem volumes de pico menores. Portanto, as fontes de alargamento de pico extracoluna (por exemplo, tubulação, volume da célula do detector, frequência de amostragem, volume de injeção) devem ser otimizadas. Quando o tamanho da partícula não for especificado na monografia, calcule L/dp usando o tamanho máximo de partícula da coluna de referência.
Tamanho das partículas (GC): O tamanho das partículas pode ser aumentado ou diminuído, desde que os requisitos de adequação do sistema sejam atendidos e a relação entre as faixas de tamanho das partículas (diâmetro máximo da partícula ÷ diâmetro mínimo da partícula) permaneça inalterada.
Taxa de fluxo (GC): Ajustável em até ±50%.
Taxa de fluxo (HPLC): A taxa de fluxo deve ser recalculada quando o tamanho das partículas mudar; colunas com partículas menores exigem maior velocidade linear para manter o desempenho. Correlacione a taxa de fluxo, o diâmetro interno da coluna e o tamanho das partículas por meio da fórmula especificada.
[Fórmula omitida]
Para eluição isocrática: Quando o tamanho das partículas muda de ≥3 μm para ＜3 μm, aumente a velocidade linear (ajustando a vazão) para evitar uma perda de eficiência da coluna superior a 20%. Por outro lado, quando o tamanho das partículas muda de ＜3 μm para ≥3 μm, reduza a velocidade linear (vazão) para evitar uma perda de eficiência da coluna superior a 20%.
Para eluição em gradiente: Não são permitidos ajustes na vazão, no diâmetro interno da coluna e no tamanho das partículas.
Além disso, o ajuste da taxa de fluxo de ±50% aplica-se apenas à eluição isocrática.
Notas:
F1 = vazão especificada na monografia; F2 = vazão ajustada
dc1 = diâmetro interno original da coluna; dc2 = diâmetro interno ajustado da coluna
dp1 = tamanho original das partículas de empacotamento; dp2 = tamanho ajustado das partículas de empacotamento
Farmacopeia Europeia
Cromatografia líquida — Eluição isocrática
Composição da fase móvel: O componente minoritário pode ser ajustado em ±30% relativos ou ±2% absolutos, prevalecendo o valor maior.
Valor de pH da fase móvel: Salvo indicação em contrário na monografia, o pH da fase móvel preparada pode ser ajustado dentro de ±0,2 unidades de pH em relação ao valor ou intervalo especificado. Para analitos não ionizáveis ​​(neutros), o pH pode ser ajustado dentro de ±1,0 unidade de pH.
Concentração de sal do tampão: A concentração de sal das soluções tampão aquosas utilizadas para a preparação da fase móvel pode ser ajustada dentro de ±10%.
Vazão: Faixa de ajuste geral de ±50%. Se as dimensões da coluna forem alteradas, ajustes maiores são permitidos; calcule usando a fórmula fornecida.
[Fórmula omitida]
Parâmetros da coluna
Fase estacionária: As propriedades da fase estacionária não devem ser alteradas (por exemplo, C8 não pode substituir C18).
Tamanho das partículas: Pode ser reduzido em até 50%; aumentos não são permitidos.
Comprimento da coluna: Ajustável em ±70%.
Diâmetro interno da coluna: Ajustável em ±25%.
Temperatura da coluna: Salvo indicação em contrário, ajustável dentro de ±10 °C em relação à temperatura indicada.
Comprimento de onda de detecção: Nenhuma modificação permitida.
Volume de injeção: Pode ser reduzido se a sensibilidade máxima e a repetibilidade forem satisfatórias; o aumento não é permitido.
Cromatografia Líquida — Eluição em Gradiente
Pequenos ajustes na composição da fase móvel/programa de gradiente são permitidos se todas as seguintes condições forem atendidas:
- Os requisitos de adequação do sistema foram atendidos;
- O tempo de retenção do pico principal situa-se dentro de ±15% do tempo de retenção original;
- A força de eluição da composição final da fase móvel não é menor do que a do gradiente original.
Caso não seja possível atingir a adequação do sistema, investigue os efeitos do volume de permanência ou considere a possibilidade de alterar a coluna.
Volume de retenção: A configuração do instrumento influencia fortemente a resolução, o tempo de retenção e o tempo de retenção relativo; um volume de retenção excessivo é uma causa comum de desvios. As monografias geralmente incluem uma retenção isocrática antes do início do gradiente. Como o volume de retenção difere entre instrumentos de desenvolvimento de métodos e instrumentos de uso prático, a duração do gradiente deve ser adequada. Os usuários devem verificar o tempo de retenção isocrática durante a confirmação do método.
Quando o volume de permanência for especificado na monografia, o ponto de tempo de eluição inicial (t _min ) deverá ser substituído pelo ponto de tempo ajustado (t _cmin ), calculado com a fórmula fornecida.
[Fórmula omitida]
Onde:
D = volume de repouso (mL); D₀ = volume de repouso durante o desenvolvimento do método (mL); F = taxa de fluxo (mL/min).
Caso a validação do método não abranja esta etapa, a descrição da retenção isocrática para este propósito pode ser omitida.
Valor de pH da solução tampão: Não é permitido ajuste.
Concentração do sal tampão: Não é permitido nenhum ajuste.
Vazão: É possível realizar ajustes quando o diâmetro interno da coluna se altera; consulte a fórmula da vazão.
[Fórmula omitida]
Parâmetros da coluna
Fase estacionária: As propriedades da fase estacionária não devem ser alteradas (por exemplo, C8 não pode substituir C18).
Tamanho das partículas: Não é possível fazer ajustes.
Comprimento da coluna: Ajustável em ±70%.
Diâmetro interno da coluna: Ajustável em ±25%.
Temperatura da coluna: Salvo indicação em contrário, ajustável dentro de ±5 °C em relação à temperatura indicada.
Comprimento de onda de detecção: Nenhuma modificação permitida.
Volume de injeção: Pode ser reduzido se a sensibilidade máxima e a repetibilidade forem satisfatórias; o aumento não é permitido.
Notas:
F1 = vazão especificada na monografia; F2 = vazão ajustada
dc1 = diâmetro interno original da coluna; dc2 = diâmetro interno ajustado da coluna
L1 = comprimento original da coluna; L2 = comprimento ajustado da coluna
Cromatografia gasosa
Parâmetros da coluna
Tamanho das partículas na fase estacionária (colunas empacotadas): Pode ser reduzido em até 50%; aumentos não são permitidos.
Espessura do filme (colunas capilares): Ajustável de −50% a +100%.
Comprimento da coluna: Ajustável em ±70%.
Diâmetro interno da coluna: Ajustável em ±50%.
Vazão: Ajustável em ±50%.
Temperatura da coluna: Ajustável com uma precisão de ±10% em relação ao valor especificado.
Volume de injeção e proporção de divisão: O ajuste é permitido, desde que os requisitos de sensibilidade máxima e repetibilidade sejam atendidos.